Avances en la fisiopatología del asma: Disfunción de la barrera epitelial.

+Gonzalo Alvear+

En esta nueva serie presentaremos los últimos avances en el conocimiento de la fisiopatología del asma. Esta primera entrega revisa el rol de la disfunción de la barrera epitelial en el desarrollo del asma.

Allergy 2020;75:1902–1917.

Introducción 

El asma es una enfermedad heterogénea, con una etiología compleja. El asma inducida por alergenos es la forma más común, con la atopia y la sensibilización alergénica, como sus principales factores de riesgo. Otros factores de riesgo incluyen las infecciones virales durante la niñez temprana, la exposición al humo del tabaco y la contaminación ambiental. Además, de la IgE en suero elevado, las características del asma atópica incluyen la inflamación eosinofílica de las vías áreas y la remodelación de la vía aérea, con aumento de la masa de la musculatura lisa de la vía aérea, fibrosis subepitelial, descamación epitelial e hiperplasia de las células caliciformes. Los linfocitos T helper tipo 2 (Th2) son participantes claves en la respuesta inflamatoria eosinofílica en la vía aérea de los individuos sensibilizados a alergenos. Otros endotipos de asma incluyen al asma eosinofílica no alérgica, la que puede ser orquestada por linfocitos innatos tipo 2, el asma granulocítica mixta, el asma neutrofílica tipo 1 y tipo 17 y el asma paucigranulocítica, sin aparente neutrofilia ni eosinofilia. 

La susceptibilidad al asma tiene un gran componente genético. Muchos genes de susceptibilidad del asma son expresados en el epitelio de la vía aérea, lo que subraya la importancia de este en el desarrollo del asma. Los alergenos, virus y otros agentes ambientales inhalados tienen su primer contacto en la vía aérea con la barrera epitelial, la que forma una cubierta continua en el sistema respiratoria, desde la nariz hasta la tráquea, bronquios, bronquiolos y finalmente los alveolos. El epitelio de las vías aéreas superiores tiene un origen embrionario diferente al de las vías aéreas inferiores y epitelio alveolar. La naturaleza del epitelio cambia en las regiones específicas, siendo un epitelio columnar seudoestratificado en la nariz, tráquea y bronquios, cambiando a cuboídeo en los bronquiolos y formando un epitelio alveolar grueso de células únicas. El epitelio alveolar está altamente vascularizado y es el responsable del intercambio gaseoso. La región de transición entre los bronquiolos terminales y los alveolos se refiere como el conducto de unión bronquioloalveolar. Las células alveolares pueden subdividirse en las células epiteliales alveolares tipo 1 (CA1), que son células aplanadas que realizan la transferencia de oxígeno hacia la sangre y las células alveolares tipo 2 (CA2), que sirven como progenitoras de las CA1, contribuyen a la regeneración del tejido alveolar frente al daño y producen el surfactante, que disminuye la tensión superficial. La capa epitelial seudoestratificada de las vías aéreas de conducción está separada del mesénquima subyacente por la membrana basal y consiste en diferentes tipos celulares epiteliales: las células basales, células caliciformes y células ciliadas son las principales. Las células basales sirven como progenitoras, siendo capaces de diferenciarse a células Clara secretoras, las que pueden diferenciarse a células caliciformes productoras de mucus o células ciliadas “limpiadoras” de mucus. Las células Clara son capaces de autorenovarse y generar células ciliadas después del daño, repoblando el tejido de la vía aérea dañado. Las células secretoras también son capaces de de-diferenciarse en células basales. Si bien algunos estudios han mostrado que las células ciliadas están diferenciadas terminalmente, otros han mostrado que estas células pueden presentar cambios dinámicos en su forma y expresión génica, para rediferenciarse en células columnares. También se ha visto que pueden transdiferenciarse a células caliciformes. 

Además, de actuar como barrera física y de limpieza mucociliar, el epitelio de la vía aérea actúa como una barrera química contra el daño ambiental al secretar, por ejemplo, péptidos antimicrobianos, antiproteasas y antioxidantes y es parte del sistema inmune innato. Las células epiteliales de las vías áreas expresan receptores de reconocimiento de patrones (PRR), como los receptores toll-like (TLR), entre otros. Estos reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) de microbios, parásitos y alergenos  inhalados, como también patrones moleculares asociados al daño (DAMP)/alarminas, liberados desde las células dañadas o muertas. Después del reconocimiento de las DAMP o PAMP, los PRR activan, “río abajo”, señales que promueven la liberación de citoquinas/quimioquinas proinflamatorias, incluyendo la IL-6, IL-8, CCL20, CCL17, TSLP, IL-25, IL-33 y GM-CSF. Estas pueden atraer y/o activar células del sistema inmune innato y adaptativo. Los alergenos, al ser sensados por varios PRR, activan complejos multiproteicos llamados inflamosomas, lo que lleva al clivaje de la IL-1β e IL-18. Durante esta respuesta inflamatoria inducida por los alergenos, las células dendríticas (CDs) inducen la diferenciación de las células Th2, las que secretan citoquinas como la IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13 e inducen la producción de IgE por parte de los linfocitos B, infiltración de eosinófilos en las vías aéreas e hiperplasia de las células caliciformes, con excesiva producción de mucus. Las alarminas epiteliales pueden orquestar respuestas similares, independientemente de los alergenos, por medio de la activación de las células linfoides innatas tipo 2 (CLI2). 

Luego del daño, por ejemplo, producido por la exposición alergénica, la barrera epitelial se rompe, promoviendo la liberación epitelial de factores del crecimiento, como el factor de crecimiento epidermal (EGF) y el TGF-β, los que activan a los fibroblastos y miofibroblastos. Esto promueve el depósito excesivo de componentes de la matriz extracelular (MEC), por ejemplo, colágeno, en la lámina reticularis, que está debajo de la membrana basal, lo que se ha denominado fibrosis subepitelial, resultando en el engrosamiento de la vía aérea y aumento en la masa de la musculatura lisa. Además, la liberación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) por las células epiteliales de las vías aéreas, aumenta el tamaño de los vasos de las vías aéreas y promueve la angiogénesis. Estos cambios estructurales son característicos de la remodelación de la vía aérea en el asma (Figura 1). Así, el epitelio de la vía aérea es crucial en la fisiopatología del asma. 

Disfunción de la barrera epitelial en el asma 

El daño epitelial es una característica patológica observada en todos los fenotipos del asma. Los cambios estructurales se han observado antes del inicio de la inflamación de la vía aérea, lo que sugiere que ocurren tempranamente en la patogénesis del asma. Esto dificulta el dogma que la inflamación crónica es la que induce la remodelación de la vía aérea. Una de las características claves de la remodelación epitelial en el asma es la pérdida de las proteínas de contacto célula-célula, las que conectan mecánicamente a las células epiteliales adyacentes manteniendo la barrera intacta. Estas uniones intercelulares están compuestas, principalmente, por las uniones estrechas (tight junctions [TJ]), que se ubican más apicalmente, las uniones adherentes (adherens junctions [AJ]) y los (hemi)desmosomas, que se ubican basolateralmente (Figura 2). Los desmosomas forman uniones adherentes con filamentos del citoesqueleto entre las células adyacentes o entre las células y la lámina propria, mediante cadherinas no clásicas. El principal constituyente de las AJ es la proteína de transmembrana E-cadherina. Su dominio extracelular se une homotípicamente a las células vecinas, mientras que su dominio intracelular se une a la actina del citoesqueleto mediante una red de proteínas formadas por microtúbulos de p120-catenina, β-catenina y α-catenina, lo que da un soporte mecánico y permite la señalización intracelular. La E-cadherina es crucial para la formación de todas las otras uniones celulares y su disrupción resulta en la deslocalización de las proteínas de las TJ. Las TJ están compuestas de las proteínas transmembranas zona occludens-1 (ZO-1), ocludina, claudina, y moléculas de adhesión de unión (JAM) y son las principales reguladoras de la permeabilidad celular. 

La expresión alterada de la E-cadherina, β-catenina, ZO-1 y ocludina ha sido reportada en el epitelio de la vía aérea de pacientes asmáticos, lo que lleva a la alteración de la función de barrera. En estudios murinos, se ha demostrado que las proteínas de unión ZO-1, Tjp2, ocludina y claudinas-5, -8 y -23, están disminuidas en modelos experimentales de asma eosinofílica alérgica, neutrofílica y granulocítica mixta. Los modelos animales también han demostrado que la deficiencia epitelial pulmonar específica de E-cadherina resulta en denudación epitelial, con pérdida específica de células ciliadas y, que la pérdida de E-cadherina en las células Clara, induce su proliferación e inhibe su diferenciación, alterando la reparación epitelial. La expresión de E-cadherina podría no sólo ser crítica para la formación de un epitelio intacto funcional, sino que también para su plasticidad, en el que las células pierden sus fenotipos epiteliales adquiriendo características mesenquimáticas, término llamado transición epitelio-mesenquimática (TEM). La inducción inicial de un fenotipo mesenquimático permite la reparación epitelial, promoviendo la migración y proliferación celular. Después de esto, las células se diferencian en una capa epitelial seudoestratificada. En el asma, este proceso de reparación puede estar alterado, lo que es apoyado por el aumento observado de marcadores de células basales y de reparación. Se ha visto que el ácaro del polvo facilita la TEM inducida por el TGF-β en células epiteliales de la vía aérea in vitro. En el asma, las células epiteliales son más susceptibles a presentar TEM mediada por TGF-β. 

La incapacidad de reconstituir la función de barrera epitelial puede tener importantes consecuencias fisiopatológicas, no sólo resultar en el aumento de la permeabilidad a los alergenos , sino que también propagar las respuestas proinflamatorias y de reparación anormal en las vías aéreas, lo que lleva a hiperreactividad y remodelación de la vía aérea (Figura 3). Así, el daño del epitelio de la vía aérea ha mostrado correlacionarse con la severidad de la hiperreactividad bronquial (HRB).

Factores de riesgo ambientales y disfunción de la barrera epitelial en el asma 

Varios estudios in vitro han mostrado que los alergenos pueden alterar la barrera epitelial de la vía aérea. La exposición de cultivos de células epiteliales de la vía aérea a alergenos proteolíticamente activos, puede llevar a la disrupción de las proteínas de unión. La exposición de las células epiteliales de la vía aérea humanas al ácaro del polvo, induce una disminución rápida y transitoria de la función de barrera epitelial, junto con la decolocación de las proteínas de unión (Figura 3). Las células epiteliales de las vías aéreas cultivadas de pacientes con asma leve/moderada, son más susceptibles a la disfunción de la barrera epitelial inducida por el ácaro del polvo que las cultivadas de sujetos sanos. 

Además de los efectos directos de los alergenos, la sensibilización alérgica puede llevar a disfunción de la barrera epitelial como consecuencia de la inflamación tipo 2 de la vía aérea asociada al asma atópica. Tanto las células Th2 como las CLI2 pueden contribuir a esta disfunción mediante la secreción de IL-13, la que ha mostrado in vitro alterar la función de barrera. 

Aparte de los alergenos, la sensibilización tempranamente en la vida a infecciones respiratorias virales bajas, es un factor de riesgo ambiental importante para el desarrollo del asma en los niños, con el mayor riesgo de progresar a asma persistente cuando coinciden ambas exposiciones (infecciones virales y alergenos). Los dos principales virus, el rinovirus (RV) y el virus respiratorio sincicial (VRS), se unen a receptores específicos del epitelio de la vía aérea. Luego de ser internalizados, se replican dentro de las células, donde son reconocidos, entre otros, por el TLR3, lo que induce la producción de interferones antivirales tipo I (IFN-1), los que erradican a los patógenos y promueven la liberación de citoquinas antiinflamatorias. La disfunción de la barrera epitelial se acompaña por compromiso de la respuesta de los IFN-1 en el asma, lo que resulta en aumento en la replicación viral. La exposición de las células epiteliales de la vía aérea al ARN del RV o VRS in vitro, induce la sobreregulación de TSLP, pudiendo iniciar una respuesta inflamatoria tipo 2. Esto podría aumentar aún más la alteración de la barrera epitelial creando un círculo vicioso, con la exposición viral causando la disrupción de los contactos célula-célula. Se ha visto que el RV altera la integridad de las TJ en líneas celulares bronquiales humanas, siendo este efecto más pronunciado y mantenido en cultivos derivados de asmáticos. 

Otros factores ambientales que podrían impactar sobre la integridad epitelial son aquellos asociados con las formas no atópicas del asma, por ejemplo, el asma no eosinofílica. Además de las infecciones virales, estos factores incluyen el tabaquismo y la colonización bacteriana. La exposición al humo causa disfunción de la barrera epitelial al alterar las uniones celulares. Indirectamente, el humo induce inflamación tipo Th17, lo que disminuye la función de barrera mediante la acción de la IL-17. La colonización del tracto respiratorio con bacterias como el Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae o Moraxella catarrhalis, puede aumentar el riesgo de asma, y es relevante el dato que las bacterias también pueden alterar la barrera epitelial. 

Finalmente, los contaminantes ambientales, como el material particulado y el ozono, y también productos de limpieza del hogar, podrían contribuir al desarrollo y/o empeoramiento del asma, pudiendo alterar la función de barrera epitelial. El material particulado ha mostrado atenuar la frecuencia de movimiento de los cilios en células epiteliales bronquiales y degradar proteínas de los TJ. Las partículas de diésel disminuyen la expresión de proteínas de las TJ en células epiteliales nasales primarias. El ozono ha mostrado causar una rápida disrupción de la barrera epitelial con aumento de la permeabilidad y disminución de la expresión de proteínas de las TJ y AJ. 

Factores genéticos y barrera epitelial en el asma 

Como se mencionó anteriormente, además de los factores ambientales, un componente hereditario contribuye al riesgo de la enfermedad, sugiriéndose que este le da un 35%-95% de mayor susceptibilidad al desarrollo del asma. Los reciente estudios de asociación genómica ampliada (GWAS) han sido bastante exitosos en identificar alelos y locus de riesgo para el asma y fenotipos relacionados. 

Los estudios sugieren que las alteraciones genéticas influencian la capacidad de los tejidos epiteliales de formar una barrera protectora, por ejemplo, contra los alergenos y patógenos. Estos hallazgos muestran que la mayoría de las variantes genéticas asociadas con el riesgo de desarrollar asma son factores de riesgo compartidos con el riesgo de desarrollo de dermatitis atópica y rinitis alérgica. Los genes identificados implicados en el epitelio se muestran en la tabla 1. Los cambios genéticos en el epitelio podrían, así, ser importantes en la mediación de varios aspectos de relevancia para el asma, incluyendo en ambiente inflamatorio. 

Aunque varios genes del asma han mostrado actuar sobre la función del epitelio de la vía aérea, algún endotipo claro derivado de la pérdida de la barrera epitelial, debido específicamente a alguno de los polimorfismos descritos en el asma, no se ha identificado aún. 

Factores epigenéticos y la barrera epitelial en el asma 

Los polimorfismos asociados al asma pueden alterar directamente las secuencias de codificación genética, alterando así la función proteica y, consecuentemente, la biología del epitelio de la vía aérea. Pero, más frecuentemente, los polimorfismos asociados al asma tienen, más bien, efectos regulatorios sobre la expresión génica. Claramente, la regulación epigenética de la expresión de los genes es altamente relevante en la traducción de la susceptibilidad a la enfermedad, en una vía aérea alterada. Marcas epigenéticas son altamente respondedoras a exposiciones ambientales relevantes al origen del asma o exacerbaciones de ella, lo que subraya la relevancia de la epigenética para entender la fisiopatología del asma. Pueden distinguirse tres marcas epigenéticas principales: metilación cpG, modificación de histonas y micro ARN no codificante. 

Varios estudios han buscado, específicamente, cambios en la metilacion del ADN inducidos por factores ambientales relevantes, lo que afecta la regulación epigenética de genes del asma. Los patrones de metilación del ADN inducidos por la infección por RV, difieren en las células epiteliales nasales entre individuos asmáticos versus controles, tanto niños como adultos. Estos y otros datos indican claramente la relevancia de las exposiciones ambientales sobre la regulación epigenética de la expresión génica en el epitelio de la vía aérea y, por tanto, para el asma. 

Además de la metilación del ADN, la expresión génica epitelial puede ser modulada por micro ARN (miARN), los que son pequeños ARN no codificantes que se unen a los ARNm, produciendo la degradación del ARNm o represión génica. Perfiles alterados de miARN se han observado en el epitelio de la vía aérea de pacientes asmáticos comparado con controles. Varios de los miARN, expresados diferencialmente, modulan la expresión de genes implicados en la función de barrera, reparación, proliferación o apoptosis del epitelio (Figura 4). 

La interacción entre los factores genéticos y los mecanismos de regulación epigenética pueden contribuir a las alteraciones del epitelio de la vía aérea y al desarrollo del asma. 

Datos de secuenciación de células únicas

Uno de los más recientes avances tecnológicos es la secuenciación del ARN de células únicas, lo que ha permitido caracterizar mejor la composición celular de los tejidos. Por ejemplo, con esta tecnología, se ha descubierto recientemente al ionocito, una nueva célula epitelial de la vía aérea. Los ionocitos son un tipo celular relativamente raro y tienen un rol en la regulación del transporte de iones y fluidos a través del epitelio de la vía aérea, como también del pH de la superficie mucosa. 

Una de las primeras descripciones del paisaje celular de la pared de la vía aérea sana y de los cambios vistos en los pacientes con asma de inicio en la niñez, identificó un estado celular epitelial de la vía aérea asociado con la enfermedad (Figura 5). Se identificó un subgrupo de células epiteliales ciliadas en el asma caracterizado por la expresión de MUC5AC y otros genes de células caliciformes, un fenotipo molecular de células ciliadas que no se observa en las paredes de las vías aéreas de individuos sanos. Estas son llamadas células de tipo ciliadas mucosas, que expresan genes inducidos por la IL-4/IL13, lo que contrasta con las pocas células caliciformes presentes en la pared de las vías aéreas de sujetos sanos. Se ha propuesto, por tanto, que estas células ciliadas mucosas representan un estado celular transicional en el linaje de las células ciliadas, inducidas por la señalización IL-4/IL-13, que lleva a un fenotipo celular mucoso que contribuye a la metaplasia de células mucosas que se ve en el asma. Como estás células efectoras patogénicas han sido identificadas exclusivamente en asmáticos, son inducidas por la señalización IL-4/IL-13 y muestran transcripción génica inducida por la IL-13, pareciera que las citoquinas Th2 son las responsables de los cambios de estado de estas células en el epitelio de la vía aérea del asmático. De hecho, se ha visto que estas células dominan el interactoma célula-célula en la pared de la vía aérea en el asma. Este interactoma permite la comunicación célula-célula entre las células epiteliales con otras células estructurales o residentes. Esta interacción está presente en sujetos sanos, pero se pierde en el asma. No se sabe aún cómo afecta esta alteración del interactoma en la función de barrera epitelial en el asma. 

Estrategias terapéuticas para mejorar la función de barrera

La terapia para mejorar la función de barrera del epitelio de la vía aérea podría ser una forma promisoria para tratar el asma y enfermedades alérgicas relacionadas. Las alteraciones intrínsecas del epitelio de la vía aérea de los asmáticos culmina en las respuestas inmunes e inflamatorias inapropiadas, como también en la reparación defectuosa. 

Varias de las vías involucradas en la mantención o restauración de la función de barrera del epitelio son accesibles, incluyendo aquellas que (a) aumentan la inmunidad innata de la mucosa, (b) disminuyen la permeabilidad epitelial mediante el ensamblaje efectivo de las proteínas de las  TJ y AJ y (c) restauran la integridad de las células epiteliales, al mejorar la regeneración y regulando de la producción de mucus. La modulación de varios factores de transcripción del desarrollo han mostrado mejorar la diferenciación epitelial y, como consecuencia, la función de barrera. Por ejemplo, la regulación de la señalización Notch tiene efectos dramáticos sobre la secreción de mucus, o los inhibidores Smad3 pueden revertir las alteraciones epiteliales de las vías aéreas que se ven en el asma. 

Debido a los efectos descritos de las citoquinas tipo 2 sobre la función de barrera epitelial, los nuevos agentes biológicos podrían ser beneficiosos sobre la barrera epitelial, específicamente en el asma tipo 2.

La mayoría de los pacientes responden bien a la combinación inhalada de corticoides (CDi) y broncodilatadores. Si los CDi tienen o no efectos directos sobre la salud del epitelio o sobre la función de barrera, no está claro. Se sabe que los CDi protegen contra la disfunción de la barrera epitelial inducida por el estrés oxidativo. El estrés oxidativo y la IL-17 pueden llevar a la resistencia a los CDo mediante modificaciones de las histonas desacetilasas 2 (HDAC2) y también mediante la degradación proteosomal de las HDCA2. Estrategias para restaurar la sensibilidad a los CDi podrían ser beneficiosas para mejorar la función de barrera epitelial en el asma en combinación con los CDi, incluyendo el uso de antioxidantes o anticuerpos α-IL-17. 

Conclusiones 

El fenotipo epitelial de la vía aérea inducido por la interacción del genotipo y el ambiente juega un papel central en la patogénesis del asma. La evidencia acumulada indica que múltiples variantes genéticas asociadas con el riesgo de desarrollar asma, en respuesta a factores ambientales, regulan proteínas de relevancia para la función epitelial de la vía aérea, incluyendo roles en la función de barrera, inflamación, limpieza mucociliar y homeostasis. Además, las alteraciones en la regulación epigenética contribuye a las alteraciones en la biología del epitelio de la vía aérea en el asma. Mayores conocimientos en estos mecanismos reguladores mantienen la promesa de identificar a los pacientes que probablemente se beneficiarán de terapias enfocadas en el epitelio y la identificación de blancos para nuevas estrategias terapéuticas enfocadas en la corrección de la barrera epitelial disfuncional.